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食品中赭曲霉毒素A的测定
发布时间:2018-09-11   点击次数:1189次

由赭曲霉(Aspergiltus Ochratoxin)和硫色曲霉(A.sulphureus)等产生的赭曲霉毒素(Ochratoxin)有A、B、C、D 四种化合物。其中,赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是重具卫生学意义的霉菌代谢产物。赭曲霉毒素A 是一种强致死性化合物,它会导致肝、肾坏死性病变。对雏鸭经口测试, LD50 仅为0.5mg/kg体重,其毒性与黄曲霉素相当。在肝癌高发区的谷物中可分离出赭曲霉素。赭曲霉素A 的污染范围较广,几乎可污染玉米,小麦等所有的谷物和中药材。

 

目前已有粮食和食品中赭曲霉毒素A 的检验标准。本文以薏苡仁、淡豆豉和白扁豆为基质,发展赭曲霉毒素A 的前处理和分离检测方法,以期对同类型的检测提供参考。

 

样品前处理

提取液

甲醇:水 (8:2, v:v)。

 

PBS 溶液

称取8 g 氯化钠、1.2 g 磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾,溶解于990 mL 水中,用浓盐酸调节pH 7,用水稀释至1 L。

 

清洗液缓冲

称取25 g 氯化钠、5 g 碳酸氢钠溶于水中,加入0.1 mL 吐温-20,用水稀释至1 L。称取15 g 中药样品加入到50 mL 离心管中,加入30 mL 提取液,加入0.75 g氯化钠,振摇后涡旋3 min,超声20 min,中间振摇3 次,11000 r/min 离心15 min后取上清液。取2 mL 上清液, 氮吹除去大部分的甲醇后,用PBS 溶液定容到10mL,过0.22 um 滤膜。取过滤后的提取液5 mL,以1 滴每3 秒流速流过免疫亲和柱,然后2~4 mL 空气排空,10 mL 清洗缓冲液、10 mL 水依次淋洗免疫亲和柱,弃去淋洗液,抽干小柱。1.5 mL 甲醇洗脱,40 ℃下氮气吹干,用流动相定容至1 mL,供检测。

 

测试用对照品的配制

使用流动相将10 mg/L 的赭曲霉毒素A 标准溶液依次稀释成3.13 μg/L、6.25μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的线性标准溶液。

 

色谱条件

色谱柱(货号):Acclaim C18

 4.6×150 mm,5 μm(货号:059148)

流动相:乙腈:水:冰醋酸 (48:51:1, v:v:v)

流速:1mL/min

检测器:荧光,Ex: 333nm;Em: 460nm

柱温:30℃

进样量:20μL

仪器:Ultimate 3000

 

实验谱图

1

线性

 

图1 线性叠加谱图(从低到高依次代表浓度为3.13 μg/L、6.25 μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的OTA 标准溶液)

 

 

图2 OTA 标准曲线图

表1 赭曲霉毒素A 线性曲线

名称 线性曲线

OTA A = 6166C + 12898,R² = 1.000

 

2

重复性

 

图3 低浓度样品(3.13 μg/L OTA)重复性

表2 低浓度样品进样重复性

名称 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 样品浓度(μg/L)

OTA 0.09% 0.67 % 3.13

 

图4 高浓度样品(200 μg/L OTA)重复性

表3 高浓度样品进样重复性

名称 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% 样品浓度(μg/L)

OTA 0.01% 0.11% 200

 

实验数据

检出限和定量限

 

图5 检出限 (0.15 μg/L OTA)谱图与空白叠加谱图

 

图6 定量限 (0.55 μg/L OTA)谱图与空白叠加谱图

表4 赭曲霉毒素A 的LOD 和LOQ

名称 保留时间(min)

LOD(S/N=3)

(μg/L)

LOQ(S/N=10)

(μg/L)

OTA 9.05 0.15 0.55

 

回收率

 

图7 薏苡仁加标回收

1- 薏苡仁样品加标; 2-赭曲霉毒素A 对照品; 3-薏苡仁样品

 

图8 淡豆豉加标回收

1-淡豆豉样品加标; 2-赭曲霉毒素A 对照品; 3 淡豆豉样品

 

图9 白扁豆加标回收

1-白扁豆样品加标; 2-赭曲霉毒素A 对照品; 3-白扁豆样品

表5 回收率数据

名称 加标量(μg/L) 加标回收率(%)

薏苡米 2.5 99.8

淡豆豉 2.5 100.2

白扁豆 2.5 97.4

 

结论

本文参考《SNT 1940-2007 进出口食品中赭曲霉毒素A 的测定方法》、《SNT1746-2006 进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A 的检验方法》和《方法报告-2013-APP-RLC-058-免疫亲和液相荧光法测定饲料中的赭曲霉毒素A》发展赭曲霉毒素A 测定的方法。以赭曲霉毒素A 对照品为样品,考察了液相方法的检测限、检出限和线性范围。以薏苡仁、白扁豆和淡豆豉为基质,考察了前处理方法的净化能力和基质干扰情况。结果表明,该前处理方法回收率高、具有较好的净化能力,赭曲霉毒素A 出峰位置附近无干扰峰,可用于薏苡仁、白扁豆和淡豆豉赭曲霉毒素A 的检测。液相方法重复性好、具有较宽的线性范围、较低的检测限和检出限。

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